Dekodiranje markerjev za hepatitis C

Označevalci hepatitisa so pojav različnih struktur bolezni. Te virusne bolezni je težko zdraviti. Hepatitis vpliva na prebavne organe.

Laboratorijska diagnoza

Zdravniki razlikujejo dve obliki bolezni:

akutni - hepatitis B in A; kronični - hepatitis C.

Zdravljenje poteka po pregledu bolnika. Glavni način za diagnosticiranje hepatitisa C, B in A je preizkus krvi za markerje virusnega hepatitisa. Proizvodnja imunoglobulina se pojavi, ko antigeni pridejo v človeško telo (jedro, sestavine, hepatitis B, C ali A ovojnica). Na začetni stopnji bolezni se proizvajajo nespecifična protitelesa. Potem se določeni imunoglobulini proizvedejo do ustrezne sestavine virusa. Da bi diagnosticirali bolezen, jih zdravniki uporabljajo v razredih G in M. Če je IgM odkrit v krvi, se v bolnikovem telesu pojavi akutni proces. Imunoglobulini razreda G kažejo na bolezen. Takšna protitelesa so glavna merila za hepatitis E in A. Z njihovo pomočjo lahko zdravnik natančno diagnosticira. Glavni znaki akutne oblike zdravnikov vključujejo:

prisotnost površinskega antigena HbsAg; Beljakovine HBeAg; imunoglobulin anti-HBc.

Za odkrivanje hepatitisa C se upošteva prisotnost naslednjih antigenov:

HCV IgM; HCV Core IgM; HCV NS.

Za natančno diagnozo zdravniki opravijo celovito diagnozo. Za odkrivanje virusnih hepatitisa B in C se protitelesa, markerji in antigeni razkrojijo. Za diagnosticiranje akutne oblike opravite naslednje laboratorijske teste:

Krvni test za markerje; PCR.

Simptomi hepatitisa

Z močno imuniteto se akutna oblika bolezni konča s popolnim ozdravljenjem bolnika. Če se bolezen nadaljuje brez simptomov, se akutna oblika lahko spremeni v kronično fazo. V tem primeru ima bolnik naslednje simptome:

jetra se povečujejo; sindrom bolečine; zlatenica; srbenje kože; šibkost; slabost; belching.

Kronična stopnja bolezni privede do postopne smrti jeter. Strokovnjaki za zaplete vključujejo cirozo. Simptomi hepatitisa C so izraženi 2-14 tednov po okužbi:

slab apetit; šibkost; moten spanec; težnost v želodcu; izpuščaj.

Ti simptomi se pojavijo 1 teden. Potem pride ikterično obdobje. Cal dobi svetlo senco. V sklepih je bolečina. To obdobje traja 3-5 tednov. Dekodiranje rezultata lahko kaže na prisotnost neaktivnega virusa ali kronične oblike bolezni. Za točno diagnozo se opravi dodatni pregled:

ALT; kvantitativni PCR; biopsija.

Z uporabo dekodiranja zadnjega pregleda zdravnik določi raven jetrnih encimov, oceni stopnjo vnetnega procesa. ALT in AST sta hepatocitni encimi. Če so celice poškodovane, gredo zunaj. S pomočjo prepisa testa krvi se ocenjujejo ravni delovanja hepatitisa, stopnje bolezni in stopnje poškodbe jeter. Po potrebi uporabite neinvazivne metode za ocenjevanje njenega stanja.

Pri biopsiji jeter specialist opravi organsko tkivo z iglo (masa materiala 0,5 g). Za takšen pregled se uporablja lokalna anestezija. Material se preučuje pod mikroskopom. S to analizo zdravnik prejme točne podatke o stopnji aktivnosti hepatitisa B.

Ocena rezultatov

Tabela virusnih markerjev proti hepatitisu omogoča odkrivanje odstopanj pridobljenih podatkov iz norm.

Pozitivni HBs kažejo prisotnost hepatitisa B in C. Če je rezultat testa negativen, potem v krvi ni HBV. Protitelesa proti površinskemu antigenu so predstavljena v obliki zaščitnih struktur. Ustvarjajo jih, ko jih injiciramo v telo 2. protitelesa. Pozitivni test kaže, da je oseba zaščitena pred virusom iz naslednjih razlogov:

cepljenje; nadzor samozavesti.

ADVICE DOCTOR! Kako shraniti jetra?!

Nikolay Zakharov, izredni profesor, doktor, hepatolog, gastroenterolog

"Žive celice dihidrokvrtetina so najmočnejši pomočnik za jetra v primeru hepatitisa. Minirana je samo iz smole in lubja divjega macesna. Poznam samo eno zdravilo, v katerem je največja koncentracija dihidrokvrtetina. To je... "

Anti-HBc se proizvaja kot odgovor na prisotnost jedrnega antigena v telesu. Rezultat tega preskusa je odvisen od dekodiranja anti-HBs in HBsAg. Ko je dosežen pozitiven rezultat, je predpisan potek zdravljenja (če bolnik v preteklosti ni bil okužen). Za odkrivanje akutne okužbe se izvede IgM anti-HBc test. Pozitiven rezultat kaže na okužbo v telesu pacienta v zadnjih 6 mesecih ali poslabšanje hepatitisa C.

Pri aktivni obliki bolezni priporočamo analizo HBeAg. Če je test pokazal pozitiven rezultat, je pacient nosilec bolezni. Hkrati je visoka infektivnost krvi. Anti-HBe je protein, ki se tvori v človeškem telesu kot odgovor na E, antigen akutne oblike bolezni.

Pozitiven rezultat kaže na razvoj nizkoaktivnega hepatitisa C zaradi nizke ravni HBV v krvi. V nasprotnem primeru se v bolnikovem telesu začne proces okrevanja.

Pozitivni test HBV DNA kaže aktivno množenje virusa hepatitisa B. Bolnik je potencialno nevaren za druge ljudi. Če bolnik trpi zaradi hepatitisa C, pozitiven rezultat takšne študije kaže na poškodbo jeter.

In malo o skrivnostih...

Ni veliko ljudi, ki vedo, da se hepatitis lahko pozdravi doma!

Zdravljenje bolezni jeter je možno brez kirurških posegov, podaljšanih tečajev antibakterijske in rehabilitacijske terapije itd.!

Če želite to narediti, potrebujete orodje z visoko vsebnostjo naravnega dihidrokvrtetina. Rezultat zdravljenja preseneča tudi izkušene zdravnike. Žive celice so minirane samo iz smole in lubja divjega macesna.

Naši bralci so potrdili učinkovitost tega načina zdravljenja! Olga Kričevska je pustila svoj pregled o zdravljenju hepatitisa tukaj >>

Bolezni notranjih, vitalnih organov so vedno strašljivi in ​​jih pogosto slabo prenaša. Oseba je bolj verjetno, da se obrne na zdravnika, če obstajajo vizualni simptomi (rdečina, itd.), Vendar je hepatitis v začetnih fazah asimptomatičen. Prvi znaki bolezni se pojavijo, ko bolezen napreduje. Za diagnozo so uporabljali označevalce virusnega hepatitisa. Za analizo se morate posvetovati z zdravnikom in vzeti vzorec krvi za pregled.

Analize

S pomočjo krvnih preiskav se začnejo diagnostični postopki skoraj vseh bolezni. Diagnostični postopek lahko vključuje enega ali več znanih označevalcev. Standardna študija praviloma sestavlja minimalni niz kazalnikov. Če je test pozitiven, se imenujejo dodatne študije, ki vam omogočajo, da ugotovite ne le prisotnost, temveč tudi obliko in stopnjo bolezni.

Posebna oblika hepatitisa je avtoimunska. Med razvojem bolezni človeško telo sprošča posebna protitelesa, ki napadajo zdrave jetrne celice. Vzrok za ta patološki proces je trenutno neznan. Hkrati je v 25% primerih avtoimunski hepatitis popolnoma asimptomatičen in se diagnosticira šele po začetku ciroze jeter. ASMA in AMA se uporabljajo kot označevalci avtoimunskega hepatitisa. Obe vrsti protiteles ali ena od njih se lahko odkrije pri bolniku.

Načini okužbe

Glavni način prenosa hepatitisa je peroralno-fekalen, kar kaže na to, da je virus prisoten v fekalni masi okuženih. Potreben je tudi stik zdravega človeka z odpadnimi izdelki pacienta. V nasprotju s splošnim prepričanjem, lahko dobite hepatitis, ne le z obiskom stranišča. Ostanke virusa lahko najdemo na ograji v javnem prevozu, gospodinjskih predmetih, revijah na javnih mestih itd. Virus vstopi v roke zdrave osebe in nato v ustno votlino. Zato je pomembno, preden jemate higieno in umijte roke z milom.

V državah, ki imajo težave s skladnostjo s sanitarnimi standardi, je lahko hepatitis epidemiološka in se prenaša prek vode.

Obstajajo še drugi načini okužbe:

Vrste bolezni B, C, D, G se lahko prenašajo med nezaščitenim spolom. Spolno aktivni ljudje in spolni delavci so ogroženi. Zdravniki priporočajo testiranje za odkrivanje markerjev za hepatitis vsake 3 mesece. Pri kirurških operacijah z uporabo darovane krvi lahko 2% biološkega materiala vsebuje virus hepatitisa. Zato je pred transfuzijo potrebno dodatno raziskati material. Okužbe lahko prenašajo s piercingom, tetoviranjem in drugimi zdravljenji z iglami. Sodobna oprema in vzdrževanje sanitarnih standardov v salonih pomaga preprečiti širjenje bolezni. Zdravniki redko opazujejo navpični način okužbe (od matere do fetusa v razvoju). Toda v primeru, ko se je ženska v tretjem trimesečju zbolela z akutno obliko virusa, se verjetnost okužbe ploda znatno poveča. V skoraj 40% primerov okužbe z virusnim hepatitisom vir ni znan.

Vrste A in E

Oblika bolezni tipa A, ki je najpogostejši tip viralnega hepatitisa. Po inkubacijskem obdobju virusa je treba opraviti preiskavo krvi za označevalce virusnega hepatitisa tipa A. Preden se pojavijo prvi simptomi bolezni, lahko traja od 7 do 50 dni. Če pa pride do stika z okuženo osebo in obstaja sum o prenosu virusa, zdravniki priporočajo več študij ob različnih časih.

Prvi bo potekal takoj, zadnji po največji inkubacijski dobi.

Simptomi bolezni spominjajo na navadno prehlad, skupaj s povišanjem telesne temperature in mrzlico. Zdravljenje je običajno uspešno in nobena bolezen ne izgine hitro. Obstajajo tudi hudi primeri, ko bolnik potrebuje hospitalizacijo in uvedbo posebnih zdravil za vzdrževanje jeter ter zmanjšanje toksičnega učinka virusa.

Vrsta hepatitisa E je zelo podobna po videzu in simptomov virusa tipa A. Pogosto diagnostiki uporabljajo označevalnike za identifikacijo obeh vrst za natančno identifikacijo virusa. Hepatitis E je hujša in zelo nevarna za ženske v nosečnosti. Za diagnozo se uporabljajo naslednji označevalci.

IgM anti-HAV. Ta vrsta protiteles se proizvaja, ko se telo aktivno bori proti virusu A. Akutna oblika bolezni je diagnosticirana. IgG anti-HAV. Protitelesa tipa G so prisotna v telesu pacienta, če ima bolezen ali če je hepatitis postal kroničen. IgM anti-HEV. Posebna vrsta protiteles, ki ustreza akutnemu virusnemu hepatitisu E. IgG anti-HEV. Uspešno ozdravljena ali kronična oblika hepatitisa E.

Vrste B in D

Oznake za hepatitis B se uporabljajo za diagnosticiranje akutnih in kroničnih oblik bolezni. Prenos hepatitisa B se lahko pojavi med pacientom in bolnikom med spolnim stikom. Tudi ta virusna bolezen se prenaša s krvjo. Okužba od matere do ploda, prenos virusa z injekcijami itd. So možne. Simptomi bolezni se začnejo z blago bolezenjo, zvišano telesno temperaturo, bolečino v sklepih.

Nato se stanje poslabša, šibkost, navzea in bruhanje.

Raziskave o označevalcih hepatitisa D pogosto predpisujemo v povezavi z analizo za tip B. Virusni tip D je vrsta satelita druge vrste bolezni, ki otežuje zdravljenje in povzroča razvoj zapletov. Za diagnostiko uporablja več unikatnih tipov markerjev. Rezultati dekodiranja so predstavljeni v obliki tabele.

Laboratorijska diagnostika hepatitisa C

MI Mikhailov, Inštitut za epidemiologijo in mikrobiologijo. N.F. Gamalei RAMS, Moskva

Pri diagnozi "hepatitisa C" je treba upoštevati naslednje najpomembnejše dejavnike:

  • kazalniki aktivnosti "jetrnih" encimov;
  • prisotnost ali odsotnost označevalcev okužbe z virusom hepatitisa C (HCV) in drugimi hepatotropnimi virusi;
  • podatki epidemiološke zgodovine;
  • rezultate kliničnega pregleda bolnika. Le celovito obračunavanje teh dejavnikov omogoča diagnosticiranje te bolezni z visoko stopnjo zanesljivosti. Laboratorij mora zagotoviti objektivne informacije o določenem spektru virusnih antigenov in protiteles ter HCV RNA, ki zdravniku, storitvenemu delavcu in epidemiologu omogoča reševanje njihovih težav. Najpogosteje je:
  • identifikacija oseb s HCV za zmanjšanje ravni hepatitisa C po transfuziji;
  • diagnosticiranje in razlikovanje med akutnim in kroničnim hepatitisom C;
  • napoved bolezni;
  • imenovanje, ocenjevanje in napoved učinkovitosti terapije;
  • preučevanje širine širjenja HCV pri populaciji in različnih skupinah prebivalstva.
    V tem primeru so glavna področja dela laboratorija:
  • razvoj in izbor najbolj informativnih metod za prepoznavanje markerjev okužbe s HCV;
  • določitev meril za objektivno oceno doseženih rezultatov;
  • razvoj optimalnih algoritmov laboratorijskih raziskav;
  • izvajanje sistema za izboljšanje kakovosti odkrivanja markerjev okužbe s HCV.

    Osnova laboratorijske diagnoze hepatitisa C je poznavanje HCV, njeno replikacijo, informacije o dinamiki pojavljanja in izginotja markerjev okužb ter sodobne imunokemijske in molekularno-biološke metode za odkrivanje antigenov, protiteles in nukleinskih kislin.

    Virus hepatitisa C. HCV je bil prvič ugotovljen leta 1988, ko je skupina raziskovalcev, ki sta jo vodila M. Houghton in Choo Q.L, uporabila nove molekularno-biološke metode raziskovanja, klonirala in sekvencirala virusni genom [I]. Delec virusa hepatitisa C ima sferično obliko s povprečnim premerom okoli 50 nm [2,3]. Poskusi vizualnega odkrivanja in preučevanja strukture virusa hepatitisa C so bili narejeni od odkritja virusa, vendar še vedno niso dobro dokumentirani rezultati teh študij, kar je lahko posledica težav pri kopičenju virusnih delcev v zahtevanih količinah.

    VGS je edini član rodu Hepacivirus v družini Flaviviridae, ki vključuje viruse, kot so virus bikarbidov in prašičje kuge (Pestivirus genus) in virus rumene mrzlice, Denge virus in GB virusi: GBV-A, GBV-B in GBV-C / HGV (rod Flavivi-rus). Strukturo virusa hepatitisa C je mogoče predstaviti na naslednji način (shema št. 1). Nukleokapsid vsebuje RNK virusa hepatitisa C. Zgoraj je nukleokapsid prevlečen z lipidno membrano s prevlečenimi ovojnimi proteini, kodiranimi z HCV RNA. Viralni genom predstavlja enojna verižna linearna molekula RNK pozitivne polarnosti z dolžino okoli 9.600 nukleotidov. Organizacija gena HCV je podobna drugim flavivirusom. Razlikuje dve coni, ki kodirajo strukturne in nestrukturne (funkcionalne) proteine. Geni, ki kodirajo strukturne proteine, se nahajajo v 5 'območju genskega virusa in nestrukturne v 3' regijah. Genotip HCV ima en odprt odčitni okvir (ORS), en sam polipeptid (približno 3000 aminokislin), ki ga prekrišejo strukturne in nestrukturne proteine ​​z virusnimi in celičnimi proteazami.

    Sl. 1. Strukturni elementi HCV

    Strukturni proteini vključujejo beljakovine, ki jih kodirajo jedra, el in E2 cone HCV RNA. Ugotovljene so bile tri oblike HCV C-proteina: polna dolžina (p21) z molekulsko maso 21 kD, okrnjeno (p19) in oblika (p16), ugotovljeno v nukleolih okuženih hepatocitov. Na svoji površini C-proteini nosijo različne zelo ohranjene epitope B celic, katerih obstoj je izredno pomemben za odkrivanje protiteles proti HCV v procesu laboratorijske diagnoze hepatitisa C.

    HCV RNA cone E1 in E2 kodirajo proteine ​​z molekulsko maso 31 in 70 kD. Ti proteini imajo več N-glikozilacijskih mest; v proteinu E1 so opredeljeni do 6 takšnih mest in v E2 - 11. V razdelku E2 so podatki o majhnih beljakovinah - p7, ki jih v strukturi virusa ne najdemo.

    Označevanje regij, ki se nahajajo blizu 3'-konca HCV RNA - kot območja, ki prenašajo informacije o nestrukturnih beljakovinah virusa, kaže, da ti proteini niso strukturne komponente virusa. V nestrukturni coni HCV RNK so odseki označeni kot: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A in NS5B. Večina proteinov, kodiranih z nestrukturnimi conami HCV RNK, je potrebna za replikacijo virusa.

    Primerjalna analiza nukleotidnih zaporedij RNK izolatov HCV, pridobljenih v različnih regijah sveta in celo v času bolezni istega bolnika, je pokazala glavno značilnost tega virusa - visoka heterogenost RNK. Položaj pomembne genetske variabilnosti HCV RNA je temeljil na teorijah, ki pojasnjujejo: dolgotrajni (včasih vseživljenjski) prevoz virusa, pogost razvoj kronične bolezni, težave pri terapiji in ustvarjanje učinkovitih cepiv. Najpomembnejše razlike v zaporedju HCV RNK so koncentrirane v N-končnem delu območja E2, ki je označena kot "hipervariabilna regija" (HVR) [4].

    Trenutno je ugotovljenih 6 glavnih genotipov in več kot 100 podtipov HCV. Genotipi 1a, 1b, 2a, 2b, 2c in Za predstavljajo več kot 90% izolatov HCV, pridobljenih v Severni in Južni Ameriki, Evropi, Rusiji, na Kitajskem, v Japonskem in v Avstraliji / Novi Zelandiji [5]. Genotipov 4, 5a in 6 so vpisani v srednji in južni Afriki ter jugovzhodni Aziji. V Rusiji in državah SND prevladuje genotip 16 (najmanj 68,9%) [6,7]. Menijo, da se bolniki, okuženi z genotipom 1 (zlasti 1c), odzivajo na zdravljenje slabše od pacientov, okuženih z drugimi genotipi virusa.

    Pri pacientu HCV kroži kot populacija virusnih delcev, v katerih se genomi med seboj razlikujejo za 1-2% (kvazi-specifičnosti) zaradi mutacij, ki se kopičijo med okužbo in / ali vstopijo v bolnikovo telo med okužbo. Te mutirane oblike lahko prispevajo k bolj aktivni replikaciji ali pomagajo virusu, da se izogne ​​imunskem odzivu telesa in potencialno vpliva na izid akutne okužbe, razlike v toku bolezni in odziv na interferonsko terapijo [8].

    OPREDELITEV ANTI-HCV. Po odkritju virusa HCV in določanju njegove vloge pri razvoju hepatitisa po transfuziji - "niti A niti B", so raziskovalci imeli nalogo razviti metode, ki bi lahko odkrile osebe s HCV in primerne za diagnosticiranje akutnega in kroničnega hepatitisa C. Ugotovljeno je bilo, da antigeni HCV krožijo v izredno nizke koncentracije in očitno je, da je metodološka raven poznih 80. let 20. stoletja, ki se uporablja za odkrivanje virusnih antigenov, očitno nezadostna.

    Leta 1989 je skupina raziskovalcev iz podjetja Chiron Corporation pod vodstvom Q-L.Choo klonirala HCV RNA in pridobila imunoreaktivne oligopeptide, ki reagirajo s protitelesi, ki krožijo v krvi bolnikov s kroničnim hepatitisom "ne A in B". Ti oligopeptidi so postali osnova za diagnostične droge za odkrivanje protiteles proti HCV. To je določalo hiter napredek pri razvoju in tržni proizvodnji diagnostičnih izdelkov. Glavna metoda, uporabljena za odkrivanje anti-HCV, je postala encimsko povezana imunosorbentna analiza, ki je metoda, ki ustreza zahtevam praktičnega zdravstvenega varstva, tj. Ima visoko občutljivost, specifičnost in enostavnost izvajanja.

    Ker HCV vztraja v krvi bolnikov z akutnim in kroničnim hepatitisom C istočasno z anti-HCV, je bila pozornost razvijalcev diagnostičnih zdravil osredotočena na razvoj testnih sistemov za odkrivanje protiteles, ki zagotavljajo najbolj popolno odkrivanje nosilcev virusa in čimprejšnjo diagnozo akutne okužbe. Različnost antigenov in antigenskih determinant, kodiranih s strukturno in nestrukturno cono HCV RNK, je določila usmeritev pri oblikovanju diagnostičnih izdelkov z izbiro in urejanjem oligopeptidov, uporabljenih za njihovo izdelavo. V času, ki je pretekel od odkritja HCV, so bili ustvarjeni diagnostični sistemi treh generacij (tabela 1).

    Tabela 1
    Diagnostični pripravki za odkrivanje anti-HCV [9]

    Uporabljeni peptidi
    območja HCV RNA, v kateri
    kodirani so

    % zaznavanje nosilca
    HCV

    Prvič
    identificirati
    anti-HCV iz
    začeti zlatenico

    5-1-1 NS3
    C100-3 NS4

    C22-3 Core
    C200 NS3 in NS4
    SZZS NS3
    Od 100-3 NS4

    C22-3 Core
    C200 NS3 in NS4
    SZZS NS3
    Peptid NS5

    Uvedba dodatnih peptidov, predvsem c22-3 (Core), v diagnostične priprave 2. in 3. generacije je omogočila rešiti glavno težavo, to je povečanje občutljivosti, specifičnosti in, kar je najpomembneje, zaznavnosti anti-HCV. Zahvaljujoč diagnostiki tretje generacije je mogoče odkriti do 97% nosilcev HCV. Hkrati je bila določena razprava posledica odločitve o uvedbi diagnostičnega peptida, ki ga kodira NS5 regija HCV RNA. Po mnenju nekaterih raziskovalcev prisotnost tega peptida ni ključnega pomena za izboljšanje kakovosti diagnostičnega zdravila. [10,11]. Vendar pa se protitelesa proti NS5 lahko odkrijejo prej v okužbi, kar izboljša kakovost laboratorijske diagnostike akutnega hepatitisa C. [12].

    Trenutno se uporabljajo po vsem svetu, vključno z Rusijo, diagnostične izdelke tretje generacije. Peptidi, uporabljeni v diagnostičnih pripravkih, so bili pridobljeni z uporabo rekombinantne tehnologije (na primer diagnostični testi podjetij: diagnostični pripravki, Nizhny Novgorod, Vector, Novosibirsk, Roche, Abbott itd.) Ali sintetični ( 000 MTS "Avicenna", Sankt Peterburg, "Organon" itd.). Diagnostikumi, pri katerih so bili hkrati uporabljeni obe vrsti peptidov, so imenovali za droge 4. generacije. Glede na njihove značilnosti ta zdravila nimajo bistvenih razlik. Primerjalni testi, ki jih redno izvaja Ministrstvo za zdravje Rusije, so pokazali primerljivo občutljivost diagnostičnih izdelkov domačih in tujih proizvajalcev.

    Ugotovljeno je bilo, da je uporaba diagnostike tretje generacije za odkrivanje anti-HCV med imunokompetentno populacijo (na primer krvodajalce) ocenjena na 98,8-100%. Hkrati je pri imunsko oslabljenih posameznikih, kot so bolniki po presaditvi ledvice, kostnega mozga ali okuženih z virusom HIV, ta številka znatno nižja - 50-95% [12]. S.George et al. [13] so pokazali, da je pri 8,4% bolnikov z okužbo s HIV zabeleženih lažno negativnih rezultatov odkrivanja anti-HCV. Poleg tega se pri takih bolnikih med opazovanjem lahko registrira učinek serološke reverzije, tj. registracija pozitivnega rezultata po seronegativnem obdobju anti-HCV [14].

    Eden od najpomembnejših problemov pri raziskovanju prisotnosti anti-HCV je lažno pozitiven rezultat. Njihov videz je lahko posledica nespecifične interakcije reakcijskih komponent, možnih navzkrižnih reakcij z drugimi virusnimi antigeni in številnih drugih dejavnikov. Raven lažno pozitivnih rezultatov pri odkrivanju anti-HCV z različnimi diagnostičnimi zdravili lahko doseže 10-20% [15,16]. Povečano raven takšnih rezultatov so opazili pri bolnikih z onkološkimi in avtoimunskimi boleznimi, osebami z imunsko pomanjkljivostjo in bolniki s sifilisom [16,17]. Obstoj lažno pozitivnih rezultatov se srečuje z laboratorijskim delavcem z nalogo, da se razlikuje od dejanskega odkrivanja anti-HCV. Za reševanje tega problema je odkrivanje serumske HCV RNA v vzorcu krvi. Vendar pa negativni rezultat odkrivanja HCV RNA ne kaže na prisotnost lažno pozitivnega odkrivanja anti-HCV. Upoštevati je treba, da anti-HCV lahko kroži v krvi bolnika, ki se je izterjal od akutnega hepatitisa C (10-15%) ali ki je izločil HCV RNA kot posledico zdravljenja.

    POTRDITEV (DODATNI) PRESKUSI. Dodatni (dopolnilni) testi so bili razviti za razlikovanje med lažnimi pozitivnimi vzorci in vzorci, ki dejansko vsebujejo protitelesa proti HCV. Najpogosteje pri teh testih se uporablja načelo imunoblota [na primer, test RIBA ("Ortho-Clinical Diagnostics"); "LiaTek HCV" (Organon Teknika)], kadar antigeni, kodirani z različnimi območji HCV RNA, adsorbirajo na nitrocelulozni membrani na nitrocelulozni membrani. Anti-HCV komunicira z adsorbiranimi antigeni z uporabo encimsko označenih protiteles proti človeškemu IgG G in njihovo nadaljnjo detekcijo z uporabo kompleksa substrata. Poleg imunoblota se kot dodatni testi uporabljajo tudi diagnostični pripravki za odkrivanje anti-HCV proti specifičnim antigenom, kodiranim z različnimi območji HCV RNK ["Spectrum 4" (Imbio, Nizhny Novgorod, RecombiBest ANTI-HCV-SPECTR) - Vektor Best ", Novosibirsk, ELISA-Anti-NSU-Spectr, NPO" Diagnostični sistemi ", Nizhny Novgorod].

    Razvoj in izvedba teh testov potekajo z roko v roki z uvedbo presejalnih testov za odkrivanje anti-HCV, ki ponavljajo načelo razširjenega spektra peptidov, ki se uporabljajo pri vsaki nadaljnji generaciji diagnostičnih izdelkov. Tako se diagnosticum RIBA-III razlikuje od prejšnje generacije z dodatkom peptida, kodiranega z območjem NS5. Načela za potrditev pozitivnega odkrivanja anti-HCV, predvsem vključujejo: možnost (v nekaterih primerih) za natančnejše rezultate encimske reakcije pri interakciji s posameznimi peptidi ter uporabo razširjenega spektra peptidov v diagnostiki, ki se ne uporabljajo pri presejalnih testih. Samo uvedba novih peptidov lahko poveča diagnostično vrednost potrditvenih testov.

    Razlaga dobljenih rezultatov, na primer v testu, kot je RIBA-III, vključuje tri možne odgovore: pozitiven, negativen in negotov rezultat. Zadnji od njih se izda v primeru odsotnosti jasnih navedb (v skladu z navodili v diagnostičnem kompletu), ki vam omogočajo, da zagotovo ocenite prisotnost ali odsotnost anti-HCV v vzorcu, ki ga proučujete. Razmerje spektra posnetih odzivov pri izvajanju potrditvenih testov se razlikuje glede na značilnosti skupin bolnikov, pri katerih se odkrije predvsem anti-HCV [18]. Po J.M. Pawlotsky et al. [19], v polovici rezultatov, ki se obravnavajo kot "nedoločeni", je mogoče odkriti RNA HCV. Po našem mnenju je legitimnost odziva - »negotov rezultat odkrivanja anti-HCV«, ki ga je laboratorijski delavec izdal zdravniku, očiten ne le pri izvedbi potrditvenega testa, temveč tudi rutinsko testiranje prisotnosti anti-HCV. Potreba po takšni razlagi rezultatov je odraz trenutnega stanja laboratorijske diagnoze hepatitisa C.

    DOLOČANJE IGM ANTI-HCV. Trenutno so izdelani in izdelani komercialno izdelani diagnostični sklopi za odkrivanje IgM anti-HCV: "Vector Best"; "Diagnostični sistemi"; Imbio, Abbott in drugi. V fazi projektiranja diagnostičnih kompletov smo izdelali komplete ELISA na osnovi peptidov, kodiranih z različnimi regijami HCV RNK [20]. Izbira je bila izvedena na peptidu, ki ga kodira Core regija HCV RNA in odkrivanje IgM protiteles proti njej. Kot pri uporabi testov za odkrivanje anti-HCV (IgG) lahko lažno pozitivne rezultate zabeležimo v IgM testu proti HCV. Po Stevensoni D.L. et al. [21] do 70% bolnikov s kroničnim hepatitisom C s prisotnostjo anti-HCV IgM je hkrati imelo povečano raven revmatoidnega faktorja, kar prispeva k pojavu lažno pozitivnih rezultatov. Vendar pa po Pawlotsky J.M. prisotnost revmatoidnega faktorja ne vpliva na kakovost detekcije anti-HCV IgM [22].

    DOLOČANJE ANTIGENOV HCV. Sposobnost odkrivanja antigenov HCV je pritegnila pozornost raziskovalcev takoj po odkritju virusa. Glavno možnost njihovega testiranja je pokazal K. Krawczynski in drugi [23], ki so imunohistokemično odkrili antigene HCV v jetrih, kar dokazuje specifičnost imunofluorescenčnega sijaja. Uporaba poli- in monoklonskih protiteles proti različnim HCV antigenom je pokazala prisotnost jedra Ag HCV, antigenov, kodiranih z NS3 in NS4 conami HCV RNK v jedru hepatocitov in citoplazem pri 60-90% bolnikov s kronično HS) [24]. Vendar so nadaljnje študije pokazale, da HCV antigene se lahko odkrijejo v manj kot 5% jetrnih celic.

    Prvi diagnostični testni sistemi ("Ortho Antibody to Core Antigen (Murine Monoclonal) EL1SA Test System" in "Imucheck F-HCV Ag Core Kokusai") za odkrivanje antigena HCV se je pojavil na trgu za imunobiološke preparate leta 1999. Cilj odkrivanja je bil Core antigen HCV, ki se določi z uporabo variante ELISA iz trdne faze, zasnovane na osnovi monoklonskih protiteles. V prvih študijah o uporabi teh testov je bila določena njihova visoka občutljivost, specifičnost in obetavna uporaba, predvsem v službi za transfuzijo krvi [25,26]. Nameščeno:

  • sposobnost določanja Core Ag HCV v serumu ali plazmi;
  • specifičnost odkrivanja HCV Core Aga;
  • prisotnost oseb s kirurškim antigenom v krvnem seronegativu za zdravljenje antigena HCV;
  • pogost (90,3%) odkrivanje Core Ag HCV v serumu s prisotnostjo anti-HCV in HCV RNA [25];
  • neposredna korelacija med koncentracijo HCV RNA in odkrivanjem Core Ag HCV [25];
  • krčenje faze "oken" - od trenutka okužbe do prvega pozitivnega rezultata odkrivanja anti-HCV. Ugotovljeno je bilo, da se Core Ag HCV lahko odkrije v 83% primerov (n = 24) naslednji dan po prvem odkritju HCV RNA [26] in dolgi (26 dni v povprečju) pred pojavom anti-HCV [27].

    METODE ODKRIVANJA HCV RNK. Sodobno fazo laboratorijske diagnoze hepatitisa C je mogoče označiti kot stopnjo začetka razširjene uporabe molekularnih bioloških metod za odkrivanje HCV RNA. Pretežna večina metod odkrivanja nukleinske kisline je bila preizkušena za odkrivanje RNA s HCV. Veliko število pregledov literature, objavljenih v ruski [28] in tujih publikacijah [29], so namenjene načelom oblikovanja diagnostičnih izdelkov in njihove uporabe za odkrivanje virusne DNA ali RNK. Vse te metode je mogoče razdeliti v dve skupini, ki temeljijo na uporabi načel hibridizacije brez pomnoževanja izbranega odseka nukleinske kisline ali z njihovo ojačitvijo, kar lahko bistveno poveča ločljivost metode.

    Metoda hibridizacije temelji na kombinaciji označenih sond za hibridizacijo (genetski inženiring ali sintetične molekulske strukture, ki vsebujejo nukleotidne sekvence, ki dopolnjujejo izbrane dele RNK). Analiza rezultatov izvedemo glede na intenziteto signala, ki prihaja iz etikete v sestavi nastalega kompleksa.

    Pri hepatitisu C je ta metoda odkrivanja HCV RNK primarno uporabljena za identifikacijo neposredno v hepatocitih in pri testih, ki jih imenujemo in situ hibidizacija [30]. Možnost neposrednega odkrivanja HCV RNA v tkivih je omogočila, da jo zaznamo v mononuklearnih celicah, celicah slinavke in drugih tkivih telesa bolnika s hepatitisom C [31,32].

    Metoda hibridizacije, ki se uporablja za odkrivanje HCV RNK, omogoča dokazovanje prisotnosti negativnih (replikativnih) verig HCV RNA, kar kaže na aktivno replikacijo virusa [33].

    Metoda verižne reakcije s polimerazo je trenutno najbolj razširjena metodična tehnika, v kateri so skoraj vse molekularne biološke metode za odkrivanje HCV RNA. Poleg tega je določitev HCV RNA mogoča tako v kvalitativni kot kvantitativni obliki, kar je še posebej pomembno pri imenovanju, spremljanju in ocenjevanju učinkovitosti uporabnega zdravljenja.

    Glavne variante metode so:

  • polimerazna verižna reakcija (PCR);
  • ligazna verižna reakcija;
  • NASBA;
  • TMA (transkripcijsko posredovana amplifikacijska reakcija, transkripcija posredovana ojačitev).

    Verižna reakcija s polimerazo je široko uporabljena metoda odkrivanja HCV RNA, tako v Rusiji kot v tujini. Temelji na več cikličnem procesu, ki spominja na naravno replikacijo nukleinske kisline, pri čemer je vsak cikel sestavljen iz zaporednih stopenj.

    Iz preučevanega materiala (serumske ali krvne plazme, biopsije jeter) je izolirana HCV RNA. Glede na to, da je nukleinska kislina HCV predstavljena z RNA, in za krepitev cDNA molekule je potrebna uporaba encimske reverzne transkriptaze, nastanejo enovalentne HCV cDNA molekule. Na naslednji stopnji so tako imenovani "HCV" pritrjeni na določen del vsake verige cDNA HCV. primerji so kratki oligonukleotidi, ki dopolnjujejo znane nukleotidne sekvence. Primerjava primarne strukture 5'UTR regije genoma različnih HCV izolatov je pokazala, da je njihova nepomembna variabilnost (med genotipi, nukleotidno homologijo 92-98% in genotipom 98-99%). Tako je bilo bolje izbrati primere iz te cone HCV RNK in njihovo uporabo v sistemih diagnostičnih testov, proizvedenih v naši državi in ​​v tujini.

    Nadalje s pomočjo encimske DNK odvisne DNA polimeraze pride do sinteze novih segmentov DNA. Trenutno se kot vir tega encima najpogosteje uporabljajo bakterije Thermophilus termus (Tth polymerase) ali Thermophilus aquaticus (Taq polymerase). Obstoj toplotne stabilnosti v prisotnosti ionov mangana in magnezija lahko ta encim istočasno uporabimo za sintetiziranje komplementarnih enovalentnih HCV cDNA molekul in ojačanje izbranih regij cDNA. Na zadnji stopnji enega cikla reakcije, ki uporablja DNA polimerazo, poteka sinteza novih pramenov komplementarnih cDNA HCV. Večkratna ponovitev reakcijskih ciklov vodi do kopičenja fragmentov cDNA HCV, ki jih je mogoče registrirati z elektroforezo poliakrilamidnega gela, ki ji sledi vizualna detekcija ali uporaba hibridizacije z oligonukleotidnimi sondami, kar povečuje občutljivost in specifičnost uporabljenih diagnostičnih izdelkov. Uporaba praškov, označenih z encimi, omogoča snemanje rezultatov PCR z uporabo encimskega imunološkega testa.

    Stalni cilj raziskovalcev, ki načrtujejo diagnostične sisteme za odkrivanje RNA HCV, je povečati občutljivost in specifičnost. Ta cilj služi različica PCR, imenovana - "ugnezdeni PCR" (vgrajeni PCR) [34]. Posebna značilnost te metode iz "klasične" je hkratna uporaba dveh par primerov, od katerih eden dopolnjuje notranji del amplikona, pridobljenega po prvem krogu ojačitve. Hkrati se domneva, da s to varianto PCR obstaja večje tveganje kontaminacije vzorcev, kar lahko privede do lažnih pozitivnih rezultatov [35].

    Akutna potreba po določitvi HCV RNA in težavah, povezanih z obsežno proizvodnjo zelo občutljivih in specifičnih diagnostičnih kompletov za diagnostiko PCR, so določili široko uporabo pripravkov, izdelanih v znanstvenih laboratorijih. Primerjava teh testnih sistemov, tako imenovani "domači" testi ("pri hišnih testih"), so pokazali visoko variabilnost občutljivosti in specifičnosti ter pomanjkanje ponovljivosti rezultatov med laboratoriji in vrsto diagnostičnih izdelkov. Tako je pri izvedbi prvega evropskega cikla "zunanjega" nadzora kakovosti za odkrivanje HCV RNA (1996) iz 136 laboratorijev le 22 (16%) lahko pravilno ugotovilo prisotnost ali odsotnost virusne RNK v predvidenih kontrolnih vzorcih [36]. Podoben rezultat je bil ugotovljen tudi v naši državi, med podobnim delom v okviru zveznega sistema zunanjega nadzora kakovosti (2001), ko je od 14 sodelujočih laboratorijev le 3 (21,4%) uspelo pravilno rešiti nalogo [37].

    Razlogi za pojav lažno negativnih in lažno pozitivnih rezultatov odkrivanja RNA s HCV so raznoliki. Za lažne negativne rezultate:
    - izgubo ali uničenje HCV RNA v pripravi na odziv kliničnega gradiva;
    - prisotnost v vzorcu inhibitorjev, ki vplivajo na različne sestavine PCR. Te inhibitorje predstavljajo različne kemične ali beljakovinske snovi. Na primer: prisotnost tekočine sperme inhibitorjev reverzne transkriptaze ni omogočila odkrivanja RNA HCV in govora o možnosti izvajanja spolnega prenosa hepatitisa C [38]; prisotnost hepaprina [39]; visok nivo krioglobulina v serumu [40];
    - neskladnost s termičnim shranjevanjem in prevozom kliničnega gradiva. Za lažne pozitivne rezultate:
    - kontaminacija med vzorci (pri obdelavi vzorcev in / ali obdelavi z reakcijsko zmesjo), vključno z onesnaženjem s pozitivnim kontrolnim vzorcem;
    - kontaminacija s produkti pred amplifikacijo (amplicons), ki lahko onesnažijo preskusne vzorce in raztopine s pomočjo aerosolov ali laboratorijske opreme.

    Množična uvedba diagnostike PCR po definiciji HCV RNA je postavila nalogo prehoda na novo raven laboratorijskih raziskav za organe zdravstvenega varstva. Osamitev izoliranih območij za izvajanje glavnih stopenj PCR (za pripravo vzorca, ojačanje, upoštevanje dobljenih rezultatov); ločen komplet za vsako fazo obleka reakcijskega laboratorija, avtomatske pipete; obstoj standardnih diagnostičnih kompletov in, kar je najpomembnejše, prisotnost visoko usposobljenega laboratorijskega osebja zmanjšuje pojav lažnih rezultatov.

    Prvi standardizirani komplet za določanje HCV RNA ("AmplicorTM HCV", "Diagnostični sistemi Roche") je bil izdelan leta 1993. Z leti so se razvili kompleti HCV RNA, katerih glavni namen je bil povečati njihovo občutljivost in specifičnost. Pri načrtovanju zdravila Amplicor TM HCV smo uporabili več izvirnih metod za identifikacijo 100 ali več kopij HCV RNK na ml. Kot tudi za obravnavo morebitnih primerov kontaminacije vzorcev in raztopin, uporabljenih v kompletu. Uporaba encima - ampersov in deiksiuridin trifosfata (dUTP) omogoča, da v prvem krogu ojačitve uničimo prejšnje aplicone, s katerimi bi lahko prišlo do kontaminacije. Uničenje ojačitve na koncu prvega ojačevalnega cikla (pri +55 ° C) ne omogoča, da encim uniči amplicone, izbrane kot tarče. Glavna novost je bila uvedba notranjega nadzora. Pomen te inovacije je v uvajanju zaporedja, podobnega ojačani regiji HCV RNK, v vsak preskusni vzorec, ki se kasneje odkrije z ustreznimi primerji v reakciji amplifikacije v podobnem načinu. Odsotnost pozitivne reakcije pri odkrivanju notranje kontrole kaže na prisotnost lažno negativnega rezultata reakcije na prisotnost HCV RNA v vzorcu v študiji. Naslednji generaciji je bila diagnosticirana zdravilo, imenovano "HCV Amplicor 2.0", ki ob uporabi uporablja mejo občutljivosti 50 molekul RNA molekule.

    Sistem za odkrivanje RNA HCV z Roche kompleti ni mogoče obravnavati ločeno od svojih instrumentov, kar določa visoko kakovost testiranja. Razvijalci metode si prizadevajo popolnoma avtomatizirati vse faze reakcije. Ideja te zamisli je bil sistem "COBASAmpliPrepTM", ki vam omogoča, da v celoti avtomatizira proces izolacije HCV RNA, ojačanja in detekcije, s čimer zmanjšate tveganje lažno pozitivnih in lažno negativnih rezultatov ob ohranjanju visoke občutljivosti in specifičnosti [41].

    Ligazna verižna reakcija za detekcijo HHC RNA (LCR). Metoda temelji na sposobnosti encima "DNA-odvisna DNA ligaza", da se šivi (ligat) prekinitev fosfodiesterne vezi v DNA v prisotnosti ionov ATP in Mg 2+. Kot pri "klasičnem" PCR za odkrivanje HCV RNA je prva stopnja LCR transverzalna reakcija za proizvodnjo cDNA HCV. Nadalje, DNA ligaza veže dva parična parka (ki dopolnjujeta 5 'nekodirano cono HCV RNA), ki sta še dodatno pomnoženi. Detekcija izdelkov za ojačenje LCR poteka ob upoštevanju reakcije antigenskih protiteles. Vsak od dveh primerjav je označen z drugačnim haptenom. Prvo od teh ujamejo protitelesa, adsorbirana na mikrodelcih. Po postopku pranja z uporabo drugega para protiteles, označenih s fluorescentno etiketo, selektivno vzajemno delujejo s haptenom v proizvodu za ojačitev, čemur sledi reakcija substrata in šteje na fluorimetru.

    Občutljivost te metode je približno 200 kopij HCV RNK na ml, kar omogoča njegovo uporabo pri reševanju različnih kliničnih diagnostičnih težav [42]. Trenutno diagnostični sklopi za odkrivanje HCV RNA, ki temelji na LCR, proizvaja Abbott.

    Amplifikacija morfidov nukleinskih kislin - NASBA metoda za odkrivanje HCV RNA temelji na sočasnem delovanju treh encimov: reverzne transkriptaze aviarne mieloblastoma, aviarne RNAaze in T7 RNA polimeraze [43.]. Za razliko od RT PCR, prvi korak ne obrne prepisa HCV RNA. Z uporabo uporabljenih encimov je mogoče v 90 minutah doseči več kot 10 (9) kopij HCV cDNA regije [44]. Možnost izvedbe reakcije pri nizkih temperaturah (+41 C) močno olajša delo in odpravlja potrebo po opremi, ki omogoča ciklične spremembe pri visokih temperaturah. Zapisi o rezultatih reakcije potekajo z uporabo elektrokemiluminiscence. Kljub dejstvu, da je NASBA v svoji občutljivosti blizu RT PCR, metoda ni pogosto uporabljena za odkrivanje RNA s HCV. Trenutno se razvija različica metode, ki združuje načela NASBA in "Real RT RT PCR".

    Tranzitna posredovana ojačitev (TMA) se razlikuje od PCR in LCR, predvsem zato, ker neposredno ojačuje fragmente HCV RNA in ne HCV cDNA. V začetni fazi reakcije se na HCV RNA pritrdi primer (št. 1) in kopija ciljne molekule, cDNA, sintetizira z uporabo encima (reverzna transkriptaza). Povratna transkriptaza, ki ima tudi aktivnost RNase-H, uniči virusno RNA v hibridni RNA-cDNA. Nato je na molekulo cDNK pritrjen drugi primer, ki mu sledi dokončanje dvojno verižne DNK z uporabo reverzne transkriptaze. S pomočjo druge encimske β-RNA polimeraze se RNA transkribira iz cDNA, kar vodi v nastanek 100 do 1000 kopij amplikona HCV RNA v enem reakcijskem ciklu. Pripomoček št. 2 je pritrjen na te Aplicone RNA z nadaljnjo sintezo kopij cDNA in uničenje molekule RNK. Pritrditev primerka št. 1 k cDNA, ki ji sledi dokončanje dvojno verižne DNA, sproži naslednji ojačevalni cikel. Zapisovanje rezultatov reakcije poteka na lumenometru, saj nastali amplikoni RNA posebej interagirajo z DNA sondami, označenimi s kemiluminom.

    Kot prednosti TMA-metode pri odkrivanju HCV RNA, je opaziti:

  • izvedba reakcije pri nižjih temperaturah v primerjavi s PCR;
  • oblikovanje večjega števila amplikonov v enem reakcijskem ciklu, kar zmanjšuje čas, potreben za doseganje končnega rezultata (30-40 minut) in povečuje občutljivost reakcije (50 kopij / ml) [45].
  • zmanjša tveganje kontaminacije, saj je RNA manj stabilna kot DNK.

    Primerjalne študije o odkrivanju HCV RNA z uporabo TMA in drugih metod so pokazale visoko stopnjo naključnosti rezultatov [45].

    Kombinacija načel hibridizacije in pomnoževanja je osnova metode odkrivanja HCV RNK, ki se imenuje "Metoda hibridizacije z uporabo razvejanih sond ali testa z blagovno DNA (bDNA)" [46]. Za razliko od PCR ta test ne ojačuje molekul cDNA HCV, temveč signal. Reakcijo izvedemo v 96-ih ploščicah, na katerih so fragmenti HCV RNA iz 5-kratnega neprevedenega območja in genski jedro HCV RNA adsorbirani, zaradi nadaljnje vezave na sintetično razvejano DNA molekulo in hibridizacijo s vzorcem, označenim z alkalno fosfatazo na diagnostičnem trgu (Vaueg 3.0 Hepati-tis C Virus RNA), ki imajo občutljivost za odkrivanje 520 IU / ml (2500 izvodov HCV RNA), so se pojavile diagnoze tretje generacije,.

    KVANTITATIVNO DETEKCIJA HCV RNA. Za oceno koncentracije HCV RNA uporabimo količinsko različico PCR. Najprej je bila koncentracija HCV RNK označena z rednimi vrednostmi, kot so "+", "++" itd., Ki vizualno odražajo intenzivnost pasov, dobljenih z elektroforezo izdelkov za ojačitev, ali s končno metodo redčenja, t.j. s prisotnostjo pozitivnega rezultata v končnem titracijsko točko. Težave pri standardizaciji vseh stopenj PCR ne dopuščajo objektivne ocene koncentracije HCV RNA, kar vodi do pomembnih napak pri interpretaciji dobljenih rezultatov.

    Trenutno so rezultati študije izraženi v količinskih enotah: število kopij HCV RNK, ki jih vsebuje 1 ml, v absolutnem ali logaritmičnem smislu (log 10). Na podlagi dejstva, da koncentracija odkrite HCV RNA odraža število virusnih delcev, se ta indikator imenuje "virusni ekvivalent (eq)", z dodatkom predpono k (kilogram, tisoč) ali M (milijon). Drug način za izražanje količine virusnih delcev je njihov masni ekvivalent. Na primer v gramih ali pikogramih (1 pg ustreza približno 1 milijonu ekvivalentov). Različne uporabljene vrednosti otežujejo interpretacijo rezultatov, pridobljenih v različnih laboratorijih. Zato je strokovni odbor WHO za biološko standardizacijo izdelal "mednarodni standardni vzorec", ki vsebuje HCV RNA (zamrznjeni suh serum, ki vsebuje HCV RNA prvega genotipa), katerega koncentracija je izražena v mednarodnih enotah (IU / mL) [47]. Posebni koeficienti omogočajo preračunavanje pridobljenih kazalcev koncentracije v mednarodnih enotah.

    Za določanje koncentracije HCV RNA se uporabljajo skoraj vse variante PCR. V tem primeru se pri diagnostičnih pripravah določijo številne posebne zahteve, od katerih je najpomembnejša stroga linearnost rezultatov, tj. povečanje signala zabeležene reakcije s povečanjem koncentracije HCV RNK v vzorcu v študiji. Uporaba notranjih standardov z različnimi ravnmi HCV RNA nam omogoča, da se izognemo številnim metodološkim napakam, ki lahko vplivajo na končni rezultat reakcije [28]. Občutljivost uporabljene diagnostike (Amplicor HCV Monitor v2.0, LCx HCV RNA kvantitativni test) omogoča odkrivanje HCV RNA, ki se začne 50 kopij na ml [48,49], kar je še posebej pomembno za napovedovanje učinkovitosti izbranega protivirusnega zdravljenja.

    PCR v realnem času (RT PCR v realnem času) je ena najbolj obetavnih možnosti za kvantitativno metodo za odkrivanje RNA HCV. Metodo in njegovo strojno opremo razvijajo specialisti Roche in Percin Elmer. Načelo metode je sposobnost hidrolizirati sekvence cDNA v smeri 5 '---- 3'. Reakcija uporablja posebno sondo, označeno z dvema fluorescenčnima barvama, ki imajo podobne absorpcijske in fluorescenčne maksime. V prisotnosti izdelkov za ojačitev Tag polimeraza cepi sondo, ki preprečuje prenos energije iz ene barve molekule na drugo in s tem preprečuje sproščanje kvantne svetlobe. Poseben instrument beleži reakcijo in matematično modeliranje fluorescenčne kinetike na vsaki stopnji reakcije, kar omogoča pridobivanje informacij o začetni koncentraciji HCV RNA.

    Posebna značilnost PCR v realnem času je sposobnost pridobivanja informacij o prisotnosti HCV RNA neposredno v reakcijskem procesu, kar omogoča zmanjšanje časa analize v kombinaciji z visoko občutljivostjo in linearnostjo rezultatov [50]. Po besedah ​​Tatyane Yashina in soavtorjev ta metoda lahko zazna 200 kopij HCV RNK na ml. [51].

    METODE GENOTIPIRANJA HCV RNA. Opredelitev HCV, ki pripada določenemu genotipu in podtipu, se uporablja za reševanje ne le zgolj znanstvenih, ampak tudi praktičnih vprašanj. Na primer: iskanje izvora okužbe med izbruhi hepatitisa C ali napovedovanje učinkovitosti uporabljene terapije.

    "Zlati standard" genotipizacije HCV je neposredna določitev primarne strukture HCV RNA s svojo naknadno filogenetsko analizo [52], kar omogoča jasno označevanje tega virusa izolata. Te informacije je mogoče pridobiti z naslednjimi možnostmi zaporedja:

  • neposredno;
  • ki temelji na standardnem kloniranju;
  • sekvenciranje reakcijskih produktov PCR (omejeno sekvenciranje).
    Kljub natančnosti rezultata se v praktičnem zdravstvenem varstvu zaradi tehničnih težav študije in visokih stroškov dela ne uporablja metoda neposrednega zaporedja. Hkrati je razpoložljivost informacij o primarni strukturi HCV RNA referenčna metoda za genotipizacijo, razpoložljivost instrumentov za avtomatsko zaporedje pa poenostavlja pridobitev rezultata.

    Trenutno se v večini primerov za genotipizacijo HCV RNA uporabljajo metode, ki temeljijo na uporabi PCR s tipsko specifičnimi primerji. Prvič je genotipizacijo HCV RNA opravil N. Okamoto in soavtorji leta 1992 z uporabo RT-PCR [53], ki vključuje dva koraka ojačanja. Prvi je bil izveden z univerzalnim, za vse HCV genotipove, primerke, drugi z mešanico tipsko specifičnih primerjev s pridobivanjem specifičnih izdelkov za ojačitev različnih dolžin. Prisotnost določenega genotipa je bila ocenjena glede na velikost ojačenega produkta. Kot primerjalke se uporabljajo tipsko specifične sonde, informacije o katerih se nahajajo v 5'UTR, Core ali NS5-RNVGS regijah [54].

    Hibridizacija ojačanih produktov s adsorbiranim genskim sondom (od 5'-neprevedenega območja HCV RNK), adsorbirane na nitrocelulozni membrani, je osnova "INNO-LiPA HCV, INNO-GENETICS" [55]. Na začetku je bilo mogoče z uporabo tega preizkusa vnesti genotipe: la; lb; 2a; 2b; 3a; 3b; 4 in 5a. V prihodnosti testni sistemi 2. generacije "INNO-LiPA HCV II, INNOGENETICS" nam omogočajo razlikovati vseh 6 genotipov in dodatno 2c; 2d; 2i; 3c; 4a-h; 6a in 10a. [56]

    Metodološki arzenal za določanje genotipov HCV ni omejen na zgornje metode in vključuje različne metode:

  • genotipizacija, ki temelji na analizi ojačanih profilov omejevalnih produktov (RFLP). Produkti amplifikacije fragmentov HCV RNA (5'UTR-regija ali regija NS5 HCV RNA) se cepijo z restrikcijskimi encimi. Nastali fragmenti se razlikujejo po dolžini, odvisno od omejitvenih mest v njih, ki se cepijo. Rezultati elektroforeze in njihova primerjava nam omogočajo prepoznati genotip HCV v vzorcu v študiji [57]. Primerjava rezultatov genotipizacije s PCR-RFLP s sekvenciranjem podatkov je pokazala visoko stopnjo naključnosti rezultatov - 95% [58].
  • genotipizacija na osnovi metode SSCP (ocena konformacijskega polimorfizma enostranskih DNA fragmentov). 5-neprevedena regija HCV RNA, ki ima minimalen niz nukleotidnih razlik, ki ločujejo genotipove drug od drugega, je bil izbran kot predmet študije. To dejstvo določa možnost uporabe skupnih pragov med genotipizacijo [59].

    SEROTYPING Anti-HCV so omogočili študije P.Simmondsa in soavtorjev, ki so ugotovili prisotnost protiteles, usmerjenih v genotipsko specifične epitope, informacije o katerih je kodirana z regijo NS4 HCV RNA [60]. S pomočjo diagnosticuma za ELISA, izdelanega na osnovi sintetičnih peptidov, je bilo mogoče razlikovati med primeri hepatitisa C, ki jih povzročajo virusi 1, 2 in 3 genotipa (89% se ujema z rezultati genotipizacije). Razvoj preskusnih sistemov s sintetičnimi in rekombinantnimi antigeni, kodiranimi z NS4 in Core z območji HCV RNA, nam je omogočil razširitev seznama vrst variant virusov ter presojo prisotnosti podtipov (1a, lb, 2a, 2b, 3a, 4a) [61,62]. Trenutno se komercialna proizvodnja diagnostičnih izdelkov za serotipizacijo izvaja na kraju samem ELISA - "Murekh NA 1-6 Serotyping Assay, Murex Diagnostics" in v varianti "imunoblot" - RIBA HCV Serotyping Assay, Chiron Diagnostics. Primerjalni podatki o rezultatih serotipizacije in genotipizacije HCV RNK so pokazali visoko stopnjo naključnosti, ki je dosegel 95% [62].

    Serotipizacija anti-HCV v primerjavi z genotipizacijo HCV RNA ima prednosti, kot so lahka reakcija in nižje stroške. Hkrati ta metoda nikakor ne more nadomestiti genotipizacije. Rezultati serotipizacije anti-HCV kažejo vrsto anti-HCV s sedanjimi ali predhodnimi okužbami. V nekaterih primerih (najpogosteje pri bolnikih s hemofilijo) je zabeleženo sočasno odkrivanje anti-HCV različnih podtipov, kar lahko kaže na večkratne okužbe z različnimi podtipi in HCV genotipov [63]. Poleg tega je pri bolnikih s hepatitisom C v ozadju izrazitega stanja imunske pomanjkljivosti lahko edini marker RNA, zaradi česar ni mogoče izvesti serotipizacije.

    IDENTIFIKACIJA IN OBRAVNAVA REZULTATOV PRESKUSA ZDRAVLJENJA ZDRAVSTVENIH ZDRAVIL HCV. Prisotnost širokega spektra seroloških markerjev trenutne ali predhodne okužbe s HCV in sodobne metodološke osnove omogoča reševanje številnih problemov laboratorijske diagnostike in preprečevanja hepatitisa C. V tabeli 2 so prikazani serološki označevalci okužbe s HCV in najpomembnejša področja njihovega testiranja.

    Tabela 2
    Diagnostični pomen markerjev sedanje ali predhodne okužbe s HCV

    Pregledovanje
    v službi
    krvi

    Potrditev
    čakanje
    rezultat
    + anti-HCV

    Ena od glavnih nalog laboratorijske diagnoze hepatitisa C je ugotoviti in razločiti akutno od kroničnega hepatitisa C z določitvijo seroloških markerjev okužbe. Kot pri drugih akutnih virusnih hepatitisih se serološki markerji okužbe s HCV dosledno pojavljajo in izginejo med okužbo in postopkom zdravljenja (slika 2).

    HCV RNA se lahko odkrije na dan 7-21 po okužbi s HCV in anti-HCV v dneh 20-150 (v povprečju 50 dni) [64]. Spekter anti-HCV se lahko spreminja glede na obdobje akutnega hepatitisa. Verjamejo, da je prvi sposoben identificirati protitelesa, ki jih kodirajo Core in NS5 cona HCV RNA. Anti-HCV za beljakovine, ki jih kodira območje NS4, niso prisotni v akutni fazi hepatitisa C [65]. Primerjalna študija ravni koncentracij anti-HCV, spektra anti-HCV in HCV RNA pri bolnikih z akutnim in kroničnim hepatitisom je pokazala nekatere razlike [66]. Po naših mnenjih so lahko te razlike povezane s posameznimi značilnostmi nalezljivega procesa, kar zmanjšuje njihovo diagnostično vrednost.

    Sl. 2. Akutni hepatitis C

    Po analogiji z laboratorijsko diagnostiko hepatitisa A in B je bilo pričakovati, da bi določanje protiteles proti IgM IgG HCV imelo toliko diagnostične vrednosti kot IgM anti-HAV in IgM anti-HBc. Vendar pa podatki o preskusih seruma bolnikov z akutnim in kroničnim hepatitisom C pri prisotnosti protiteles IgG proti HCV kažejo, da jih pogosto najdemo pri teh bolnikih - 50-93% in 50-70% [67,68], kar kaže na to, da je odkrivanje protiteles IgM - HCV ni mogoče uporabiti kot označevalec akutne okužbe s HCV.

    Odsotnost označevalca, ki zahteva vlogo "zlatega" standarda akutnega hepatitisa C, določa potrebo po celoviti oceni doseženih rezultatov na podlagi dinamičnega opazovanja bolnika.

    Nič manj pomembna usmeritev uporabe zelo občutljivih metod testiranja HCV RNA zmanjšuje tveganje za razvoj hepatitisa C po transfuziji. Potreba po takšnem delu je odvisna od prisotnosti faze "oken", tj. čas med prvim odkrivanjem RNA HCV in pojavom anti-HCV ter obstojem krvodajalcev (bolniki s kroničnim hepatitisom C), ki imajo HCV RNA v odsotnosti anti-HCV. Sedanji sistem za spremljanje darovane krvi za HCV vključuje samo testiranje proti HCV in ostane tveganje za okužbo s hepatitisom C. Na podlagi tega je vprašanje preizkušanja krvi za prisotnost HCV RNA z uporabo sodobnih metod (metode NAT - "test nukleinske kisline") legitimno. Dejavnik, ki omejuje to delo, je visok strošek raziskav. Da bi zmanjšali stroške, je priporočljivo testirati skupino krvnih serumov (od 8 do 96 vzorcev), ki jim sledi iskanje pozitivnega vzorca pri odkrivanju HCV RNA v bazenu serumov. Ob upoštevanju faktorja redčenja želene HCV RNK pri sejanju krvnih serumov postane ključno vprašanje uporabe najbolj občutljivih metod odkrivanja. Menimo, da lahko uporaba diagnostičnih kompletov za NAT - s senzitivnostjo 50-100 IU / ml znatno zmanjša tveganje za hepatitis C po transfuziji.

    Nedvomno je seznam vprašanj, ki jih je mogoče rešiti pri testiranju celotnega spektra markerjev okužbe s HCV, omejen na ta dva področja. Razpoložljivost sodobnih preskusnih metod v kombinaciji z znanjem o njihovih zmožnostih odpira široke možnosti za znanstveno in uporabno delo pri hepatitisu C.


  • Več Člankov O Jetrih

    Ciroza

    Kako se trajno znebiti presežnega žolča v telesu

    Kako odstraniti žolč iz želodca? Refluks, to je refluks izločkov iz jeter nad žolčnikom, se pojavlja zaradi rednih prehranskih motenj ali podaljšanega stresa.
    Ciroza

    Žolčni kamni - vzroki, simptomi in zdravljenje

    Žolčnik je organ, ki nabira žolč, ki ga proizvaja jetra. Slednje je potrebno za prebavo hrane. Če je potrebno, se vrže v dvanajsternik. Žolč je kompleksna snov z veliko količino bilirubina in holesterola.